AGROBIT
ENFERMEDADES
DEL TOMATE
Obtención de reactivos de
diagnóstico para el Tospovirus
Tres especies
miembro del género Tospovirus que producen importantes pérdidas económicas en el
cultivo de tomate en la Argentina son:
·
tomato
spotted wilt virus
(TSWV),
·
groundnut
ring spot virus (GRSV)
y
·
tomato
chlorotic spot virus
(TCSV).
Los
Tospovirus poseen partículas virales esféricas entre 70-110 nm de diámetro que
presentan una envoltura membranosa con proyecciones superficiales. Su genoma,
cuya organización es exclusiva entre los virus vegetales, consiste en 3 ARNs de
cadena simple que asociados con la proteína de la nucleocápside (proteína N)
forman estructuras pseudocirculares.
Para
estudios epidemiológicos, de prospección y evaluación de resistencia se
requieren métodos de diagnóstico sensibles y confiables.
Este grupo de
trabajo ha ajustado técnicas y desarrollado reactivos de diagnóstico serológicos
y moleculares que permitan alcanzar dichos estándares de sensibilidad y
confiabilidad.
Producción de antisueros
Se han obtenido
antisueros contra el TSWV y el GRSV utilizando como antígenos proteína N
purificada de planta enferma y proteína N recombinante expresada en E.coli. De
estos cuatro antisueros, los obtenidos contra proteínas recombinantes mostraron
mayor especificidad (menor o nula reacción contra planta sana y/o contra otras
especies de tospovirus) que los obtenidos contra proteína viral purificada desde
plantas enfermas (Fig. 1). Con estos antisueros se ajustaron técnicas
serológicas como DAS-ELISA y RIPA.
Ajuste de la técnica rápida de
inmunodetección en papel de filtro (RIPA).
La RIPA es una excelente
herramienta para detectar tospovirus en el campo. Las propiedades de esta
técnica que aventajan a la ELISA son: no requerir de mano de obra especializada
ni de equipo sofisticado, corto tiempo y bajo costo de realización.
La RIPA
consiste en la visualización de la reacción antígeno-anticuerpo como una banda
de color sobre una tira de papel de filtro.
Hay antecedentes sobre el
desarrollo de esta técnica para la detección de otros virus como: CMV (cucumber
mosaic virus), TMV (tobacco mosaic virus), bean yellow mosaic virus (PStV) onion
yellow dwarf virus (OYDV) siendo ésta la primera vez que se ajusta para
tospovirus.
Se trabajaron varias alternativas en esta técnica y
finalmente se optó por la “RIPA de dos pasos”. En este método el papel posee una
banda de látex blanco sensibilizada con anticuerpos específicos. Se incuba en
una dilución de la muestra problema durante 10 minutos. Por último se vuelve a
incubar durante 20 minutos en una solución de látex de color (rojo, azul, etc.)
sensibilizada con anticuerpos específicos. El látex de color al difundir por el
papel reacciona con el antígeno inmovilizado en la banda de látex blanco
tornándola de color visible.
Esta técnica se ajustó en nuestro
laboratorio para la detección del GRSV y del TSWV. En ambos casos se utilizaron
antisueros producidos en el IFIVE a partir de proteínas recombinantes expresadas
en E. coli.
Tomate
“peste negra”: Generación de plantas transgénicas resistentes a
Tospovirus.
La resistencia a tospovirus en plantas transgénicas portadoras
del gen N es mediada por RNA e involucraría mecanismos de silenciamiento génico
postranscripcional. Este tipo de resistencia es por lo general muy efectiva,
próxima a la inmunidad, pero altamente específica, es decir de muy estrecho
rango.
Nuestro grupo está desarrollando construcciones génicas tendientes
a lograr un más amplio rango de cobertura de resistencia a tospovirus si
disminuir su efectividad. Dichas construcciones serán probadas inicialmente en
tabaco y luego en tomate (Lycopersicon esculentum) y lechuga (Lactuca
sativa).
Por esta razón, tanto en tomate como en lechuga se encuentran
avanzados los trabajos de regeneración de plantas completas y se están iniciando
los trabajos de transformación de variedades argentinas con valor comercial en
ambas especies hortícolas con genes reporteros.
Producción de
antisueros anti PDV y PRSV utilizando proteínas recombinantes como
antígenos
El miembro típico del grupo, el tobacco streak virus es el
mejor caracterizado aunque los Ilarvirus comprenden al menos 16 virus más,
muchos de los cuales son patógenos de especies leñosas. Son virus fitopatógenos
que poseen partículas esferoidales de 28 mm de diámetro y que se caracterizan
por poseer genoma tripartito de RNA simple cadena de sentido positivo con un
cuarto RNA subgenómico que es también encapsidado independientemente.
En
la Argentina. se reconoció la presencia del prunus necrotic ring spot virus
(PNRSV) y del prune dwarf ilarvirus (PDV) en las colecciones de prunoideas
mantenidas por EEA-INTA, Facs. de Agronomía (Univ. Nac. de Córdoba) y en montes
de producción, durante 1989-1994.
Dado lo complejo de la purificación de
partículas de Ilarvirus a partir de plantas infectadas se decidió clonar el gen
de la cápside proteica de los dos llarvirus presentes en Argentina (PDV y PNRSV)
y expresarlos en un sistema procariote para ser usados como inmunógeno .
En
la actualidad se está trabajando en el ajuste de un DAS-ELISA para PDV y para
PNRSV.
Caracterización
molecular de aislamientos chilenos del plum pox virus, agente causal de la
enfermedad de sharkas.
El plum pox virus es el agente causal del sharkas
(viruela) de los frutales de carozo (durazneros, ciruelos, damascos y cerezos),
virosis que se caracteriza por ocasionar serias pérdidas en la producción de los
Prunus. Los primeros síntomas de la enfermedad aparecen en hojas como manchas,
anillos o bandas cloróticas. En los frutos inmaduros, se evidencian anillos o
manchas y por debajo de éstas la pulpa se torna castaño-rojiza y se satura de
gomas que llegan hasta el carozo.
Argentina requiere definir si el PPV ha
sido introducido al país y establecer la identidad del PPV encontrado en Chile
mediante su caracterización molecular a fin de establecer diferencias o
similitudes con los ya secuenciados en Europa. Estos conocimientos permitirán
orientar medidas destinadas al manejo del PPV presente en Argentina o de su
prevención.
En este plan se pretende alcanzar la caracterización molecular
mediante el clonado y secuenciación del extremo 3’del RNA genómico de los
aislamientos del PPV presentes en los montes de prunoideas de Chile que a su vez
pueden estar presentes en los montes de Argentina y establecer diferencias o
semejanzas con razas ya secuenciadas en Europa. Al mismo tiempo se intentará la
producción de reactivos de diagnóstico empleando proteínas recombinantes como
antígenos, para ser empleados en la detección del PPV.
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